宁波市商贸数智综合服务平台

1 范围 本标准规定了畜禽产品的检验项目、检验方法、抽样方法、判定原则及复检。 本标准适用于浙江省境内生产、屠宰或销售的畜、禽产品的质量安全监督抽查。 本标准不适用于经深加工的畜、禽产品质量安全监督抽查。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 4789.2 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定 GB/T 4789.4 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 5009.12 食品中铅的测定方法 GB/T 5009.15 食品中镉的测定方法 GB/T 14931.1 畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留测定方法（高效液相色谱法） GB/T 14931.2 畜禽肉中己烯雌酚的测定方法 NY 5029-2001 无公害食品 猪肉 DB33/T 307-2001 可食性动物组织中盐酸克仑特罗残留量的测定方法 DB33/T 309-2001 动物尿液中盐酸克仑特罗残留量的检测方法 3 抽检产品和检验项目 3.1 猪尿样检验项目见表1。 表1 猪尿样检验项目 样品名称 检验项目 要 求 猪尿样 盐酸克仑特罗 不得检出(检出限0.005 mg/kg) 莱克多巴胺 不得检出(检出限0.005 mg/kg) 注：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 3.2畜禽肉类检验项目见表2。 表2 畜禽肉类检验项目 样品名称 检验项目 要 求 猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、鸭肉、兔肉 盐酸克仑特罗（猪肉） 不得检出(检出限0.01 mg/kg) 金霉素（mg/kg） ≤0.10（猪肉、羊肉、牛肉） ≤1（鸡肉） 土霉素（mg/kg） ≤0.10 氯霉素 不得检出(检出限0.01 mg/kg) 磺胺类(以磺胺类总量计)（mg/kg） ≤0.10 呋喃唑酮 ≤0.1（鸡肉、兔肉） 表 2 （续） 己烯雌酚 不得检出(检出限0.05 mg/kg) 铅（mg/kg） ≤0.10 ≤0.50(猪肉、牛肉) 镉（mg/kg） ≤0.10 沙门氏菌 不得检出 注1：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 注2：磺胺类总量指磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉含量之和 3.3 畜禽肝脏检验项目见表3。 表3 畜禽肝脏检验项目 样品名称 检验项目 要 求 畜、禽肝脏 盐酸克仑特罗（猪肝） 不得检出(检出限0.01 mg/kg) 磺胺类(以磺胺类总量计)（mg/kg） ≤0.10 四环素（mg/kg） ≤0.3 铅（mg/kg） ≤0.10（猪肝） 镉（mg/kg） ≤0.10（猪肝） 沙门氏菌 不得检出（猪肝） 注1：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 注2：磺胺类总量指磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉含量之和 3.4 蛋类检验项目见表4。 表4 蛋类检验项目 样品名称 检验项目 要 求 鸡蛋、皮蛋、咸鸭蛋 土霉素（mg/kg） ≤0.1 ≤0.2（皮蛋、咸鸭蛋） 呋喃唑酮 ≤0.1（鸡蛋） 磺胺类(以磺胺类总量计)（mg/kg） ≤0.1（鸡蛋） 铅（mg/kg） ≤0.1（鸡蛋、咸鸭蛋） ≤0.5（无铅皮蛋） ≤2.0（普通皮蛋） 镉（mg/kg） ≤0.05 大肠菌群(MPN/100g) ≤100（鸡蛋、咸鸭蛋） ≤30（皮蛋） 沙门氏菌 不得检出 注1：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 注2：磺胺类总量指磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉含量之和 4 检验方法 4.1 盐酸克仑特罗 4.1.1 猪尿样中盐酸克仑特罗：按DB33/T 309-2001规定检验。 4.1.1.1按DB33/T 309-2001中第一篇的规定筛选。 4.1.1.2筛选结果为阳性的样品按DB33/T 307-2001中第二篇的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.1.2 猪肉和肝脏中的盐酸克仑特罗 4.1.2.1按DB33/T 307-2001中第三篇的规定筛选。 4.1.2.2筛选结果为阳性的样品按DB33/T 307-2001中第二篇的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.2 莱克多巴胺 4.2.1按本标准附录A中方法1筛选。 4.2.1筛选结果为阳性的样品按本标准附录A中方法1的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.3土霉素、金霉素、四环素 4.3.1按本标准附录B的规定筛选。。 4.3.2筛选结果为不合格的样品按GB/T 14931.1 的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.4 呋喃唑酮 按NY 5039-2001中附录A规定检验。 4.5氯霉素 4.5.1按本标准附录C的规定筛选。。 4.5.2筛选结果为阳性的样品按NY 5029-2001中附录D的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.6磺胺类 4.6.1按本标准附录E的规定筛选。 4.6.2筛选结果为不合格的样品按NY 5029-2001中附录E的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.7 己烯雌酚 4.7.1按本标准附录D的规定筛选。。 4.7.2筛选结果为阳性的样品按GB/T 14931.2的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.8 铅 按GB/T 5009.12规定检验。 4.9 镉 按GB/T 5009.15规定检验。 4.10 大肠菌群 按GB 4789.3规定检验。 4.11 沙门氏菌 按GB 4789.4规定检验。 5 抽样方法 5.1 组批 产地检验以同一养殖场、同一品种、同一批饲养的动物或动物产品为一抽样批次。屠宰、加工环节的抽样以同群动物或动物产品为一抽样批次。市场抽检以同一产地、同一品种、同一批号的产品为一批次。 5.2 抽样方法 采取随机多点抽样，样品数量：猪尿样不少于50ml，肉不少于1000g，肝脏不少于500g(鸡鸭肝脏不少于6只完整的肝脏)，蛋类不少于20个。混合后平均分成二份。 5.3 注意事项 5.3.1 抽样时抽样人员应认真填写《浙江省农产品质量监督检查抽样单》，样品一式二份，其中一份用于检验，一份为备样。 抽取的样品应采用干净容器妥善保存，尿样和蛋类应保存于4℃条件下，肉和肝样品于-10℃以下保存。 5.3.2 抽样后应及时将样品送至相应的检验机构检验。 5.3.3 抽样单位或人员应采取必要的措施，保证送检样品满足检验需要。 6 判定原则 6.1 药物残留项目盐酸克仑特罗、莱克多巴多胺、土霉素、金霉素、四环素、氯霉素、己烯雌酚可按本标准规定用酶联免疫法筛选。筛选结果在规定限量范围内的，单项判定为合格，超出规定范围的，必须按本标准规定的第二种方法重新检验，检验结果仍不合格的，单项判定为不合格；本法检验结果合格的，则单项判定合格。 6.2按本标准检验，所有项目均符合标准要求，判定该批样品为合格；有一项或一项以上不符合标准要求的，判定该批样品不合格。 7 复检 检验结果有异议时，可申请复检（微生物指标除外），微生物指标不予复检。复检申请向原检验机构提出。原检验机构应在三个工作日内做出受理或不受理决定。若受检方对不受理决定仍有异议的，可由受检单位向农产品质量安全监督检测协调会议办公室提出。不合格结果以检验结果通知书方式送达受检方。受检方应在收到不合格通知之日起三日内提出复检申请，逾期不予受理。 附 录 A （规范性附录） 动物尿样中莱克多巴胺残留量的检测方法 方法1 酶联免疫色谱法 A.1 原理 利用固相酶联免疫吸附原理，加入尿样及酶标莱克多巴胺抗原（已知抗原）与抗体进行免疫竞争反应，未反应的酶标物在洗涤中被清除，结合了的酶可以由显色物显示出来。用目测法或酶标法来判断。显色的强弱与样品中的莱克多巴胺成反比。 A.2 试剂与材料 美国TCC莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品。 A.3 仪器与设备 A.3.1 微孔板酶标仪(450nm)。 A.3.2 振荡器。 A.3.3 离心机（0 rpm -10000rpm）。 A.3.4 20ul, 50ul, 100ul, 200ul微量加样器及配套吸头。 A.3.5 冰箱（2℃-8℃）。 A.3.6 洗板机。 A.4 测定步骤 A.4.1样品处理 用PBS缓冲液以1：3稀释尿液样品，4000转离心5分钟，取上清液测定。 A.4.2使用之前将所有试剂回升至室温20℃-24℃。 A.4.3将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。 A.4.4加入50ul的标准和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。 A.4.5加入100ul第一抗体溶液到每一个微孔中底部，在37℃孵育30分钟后用工作洗液洗板，最后用洗水纸洗干。 A.4.6加入150 ul稀释的酶标记的第二抗体37℃孵育30分钟后用工作洗液洗板，最后用洗水纸洗干。 A.4.7 加入100ul底物液到微孔中，充分混合并在室温孵育3分钟-8分钟。 A.4.8 加入50ul反应终止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值。 A.5 结果计算 以0标准吸光度值为100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。 标准的吸光度值(或样品) 相对吸光度值（%） = ---------------------------------x 100 0标准的吸光度值 计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200 ng/L -2000ng/L(ppt)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度(ng/L)可以从校正曲线上读出。 本方法检测限为500ng/L。 A.6 注意事项 A.6.1 试剂盒应放在2℃-8℃保存。 A.6.2为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 方法二 气相色谱―质谱法测定 A.7 原理 动物尿样中总的莱克多巴胺需要通过β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解，本方法仅测定尿样中游离的莱克多巴胺含量。用乙酸乙酯提取后，提取液蒸发至干，用乙酸乙酯溶解后加到SPE-SLH净化柱上，先用乙酸乙酯溶液洗脱除杂，然后用10%乙醇/乙酸乙酯将莱克多巴胺洗脱，洗脱液蒸发至干后，用BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，然后用GC/MS法测定 图A.1 标准莱克多巴胺分子结构式 A.8试剂 莱克多巴胺标准品（纯度大于98%）； 甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水、无水硫酸钠等均为分析纯； BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）、TMCS （三甲基氯硅烷）。 CLE―SLH型SPE净化柱或同等效果的净化柱。 莱克多巴胺标准储备溶液（5mg/mL）：准确称取50mg 莱克多巴胺于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用。使用时稀释到一定浓度。 A.9 仪器设备 色质联用仪 ； 旋转蒸发仪； A.10 试验方法 A.10..1样品处理 A.10..1.1 莱克多巴胺的提取 ：取10.0mL动物尿样，加10 ml乙酸乙酯，振荡萃取，重复2次，有机相过无水硫酸钠在60℃水浴中真空蒸发，氮气吹干。 A10.1.2 加4.0 ml乙酸乙酯溶解剩余物，移2mL到CLE-SLH型SPE净化柱上，然后用10mL乙酸乙酯淋洗除杂，最后用10mL10%乙醇/乙酸乙酯（V：V）洗脱，洗脱液在水浴中蒸干，氮气吹干。 A.10.1.3莱克多巴胺的衍生 蒸发剩余物,加0.12ml BSTFA+1%TMCS，加盖于旋涡混合器上震荡，氮气吹干，加0.2mL甲苯溶解，在4000r/min下离心10 min。取适量的莱克多巴胺标准溶液，氮气吹干，同时进行衍生化。取离心后1.0μL甲苯溶液进行GC--MS分析。 A.10.2 检测 A.10.2.1色谱条件 色谱柱：HP―5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)； 进样口温度300℃， 柱温程序：初温150℃，保持3 min，然后以10℃／min升至230℃，保持10min，再以20℃／min升至280℃保持 10min ； 载气为高纯氦气（99.999%），流速1.0mL/min，不分流进样。 A.10.2.2 质谱条件 EI源 源温 230℃； 电子能量70eV； 接口温度280℃； 电子倍增器电压1506V ； 质量扫描范围30 U～550U； 选择离子监测方式（SIM）；监测离子（m/z）：267、250 、179、502。 溶剂延迟：5 min 。 A.10.3 结果计算： 定量方法：采用单点或多点校准法定量 。 莱克多巴胺（以莱克多巴胺计）X=m1*D/m 。 X ：尿样中莱克多巴胺含量ng/ml。 m1：质谱测定对应的莱克多巴胺含量ng/ml。 m ：取样量ml。 D ：稀释倍数 。 附 录 B （规范性附录） 可食性动物组织中四环素的检测方法（ELISA法） B.1 测定原理 测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有结合到蛋白上的四环素（固相）。四环素抗体, 四环素标准或样品溶液被加入， 游离的四环素与固相四环素竞争四环素抗体，没有连接的四环素抗体在洗涤步骤中被除去。加入酶标记物（过氧化物酶标记的第二抗体，针对四环素抗体）。然后在洗涤步骤除去未结合的酶标记物。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量（可选择大于600nm的波长作为参比波长），吸收光强度与样品中的四环素浓度成反比。 B.2 试剂和材料 B.2.1 四环素酶联免疫试剂盒：德国R-Biopharm公司生产或类似产品。 B.2.2 RIDA C18 柱。 B.2.3 甲醇。 B.2.4 Mcllvain-buffer：12.9g Citric acid monohydrate，10.9g Na2HPO4，37.2g EDTA-Sodium salt，调pH3.8，加蒸馏水至1000ml。 B.2.5 洗脱液：甲醇含20mM Oxalic acid （=1.8g/l）。 B.3 仪器和设备 B.3.1 离心机。 B.3.2 组织均质仪。 B.3.3 酶标仪（含450nm滤光片）。 B.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 B.4 样品处理 ----5g 粉碎的样品与25ml Mcllvain-buffer 混合30分钟，然后10 0C离心10分钟 （3500g），保存上清液，沉淀物重复提取一次，将两次的提取液合二为一（50ml）用折叠滤纸过滤。取5ml滤液用RIDA C18柱按以下步骤纯化： ----用4ml甲醇(100%)洗涤柱子。 ----用3ml 蒸流水洗涤柱子。 ----取5ml滤液样品进柱。 ----用3ml 蒸流水洗涤柱子。 ----小心的压出所有的液体。 ----用2ml甲醇/ Oxalic acid 洗脱样品,流速为15滴/分钟。 ----洗脱液用样品稀释缓冲液以1：10稀释，取50ul 进行分析。 B.5 工作液的准备 B.5.1 标准浓缩液 制备四环素标准应用液：50ul标准浓缩液用450ul缓冲液1稀释并混合均匀，不要用塑料瓶而用玻璃瓶。 标准液1：50ul标准浓缩液1用450ul缓冲液1稀释 0ppt。 标准液2：50ul标准浓缩液2用450ul缓冲液1稀释 50ppt。 标准液3：50ul标准浓缩液3用450ul缓冲液1稀释 150ppt。 标准液4：50ul标准浓缩液4用450ul缓冲液1稀释 450ppt。 标准液5：50ul标准浓缩液5用450ul缓冲液1稀释 1350ppt。 标准液6：50ul标准浓缩液6用450ul缓冲液1稀释 4050ppt。 B.5.2 洗涤缓冲液，PBS-T（含有土温20的磷酸缓冲液盐水） (0.55g NaH2PO4 X H2O+ 2.85g Na2HPO4 X2H2O+9gNaCl + 1ml Tween20, 加入蒸流水至1000ml)；pH7.2-7.4。 B.6 实验步骤 B.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温（约1小时）。 B.6.2 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 B.6.3 加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中。标准和样品做两个平行实验。 B.6.4 加入50ul四环素抗体溶液到每一个微孔底部，在室温孵育60分钟，覆盖上薄膜（防止蒸发）。 B.6.5 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。用250ul PBS-T缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上。 B.6.6 加入100ul酶标记物到微孔中， 手动充分混合并室温敷育15分钟。 B.6.7 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。用250ul PBS-T缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上。 B.6.8 加入 50ul基质和50ul发色试剂到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15分钟。 B.6.9 加入100ul反应停止液到微孔中。混合好在450nm处测量吸光度值以空气为空白，必须在加入停止液后60分钟内读取光度值。 B.7 结果计算 以0标准吸光度值为100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。 标准的吸光度值(或样品) 相对吸光度值（%） = ---------------------------------x 100 0标准的吸光度值 计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在150-1350ng/l(ppt)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度(ng/l)可以从校正曲线上读出。 本方法四环素，金霉素的检测下限为6ng/g，土霉素的检测下限为60 ng/g。 B.8注意事项 B.8.1 试剂盒应放在2℃-8℃保存。 B.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 B.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。 附 录 C （规范性附录） 可食性动物组织中氯霉素的检测方法（ELISA法） C.1 原理 基本的原理就是抗原-抗体反应。微孔中用羊抗兔IgG包被，抗氯霉素抗体、氯霉素的酶标物、氯霉素标准品或样本加入后，4℃下温浴2小时，清洗去除未结合的酶标物，加入酶底物（H2O2）和显色剂（TMB），室温下避光温浴30min，加入反应中止液会使微孔中的兰色转变为黄色，在450nm处进行吸光度测量，通过计算比例可以获得氯霉素的浓度值。 C.2 试剂和材料 C.2.1 磺胺类药物酶联免疫试剂盒：意大利Tecna公司生产或类似产品。 C.2.2 样品抽提液（PBST） 试剂盒没有提供样品抽提液，请按下面的成分配置（1L）： Na2HPO42H2O 0.96 g KH2PO4 0.17 g NaCl 9 g Tween 20 0.5 ml 蒸馏水 1000 ml C.3 仪器和设备 C.3.1 离心机。 C.3.2 组织均质仪。 C.3.3 酶标仪（含450nm滤光片）。 C.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 C.4 样品处理 称取3g均质化后的组织样本加入一试管，加6ml 醋酸乙酯混匀抽提30min，离心（2000g,10min）后6ml 醋酸乙酯转移到另一试管并在氮气中50℃蒸干，脂质残留物用1.5ml异辛烷/氯仿（2:3；v/v）重新溶解，加0.75mlPBST后混匀30min，离心（2000g,10min），注意：为避免上层液乳化，试管在80℃短暂水浴（约2min）然后离心。取50ul上层液体进行检测。 C.5 工作液的准备 C.5.1 标准品溶液 已经备用。 C.5.2 酶标物 本品是浓缩物，酶标物经过稀释以后稳定性降低，因此要根据用量进行稀释。本浓缩物可以用稀释液稀释100倍（即10ul酶标物+990ul稀释液）。 C.5.3 清洗液 用蒸馏水10倍稀释。 C.5.4 稀释液 用蒸馏水10倍稀释。 C.5.5 中止液 已经备用。 C.5.6 显色底物溶液 本溶液应该在使用前根据用量由H2O2和TMB等体积混合得到。 C.6 实验步骤 C.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温。 C.6.2 预先进行编号，标记B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 C.6.3 用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复3次，在吸水纸上拍打将微孔中的液体去除。 C.6.4 空白孔加150ul稀释液，标准孔加50ul标准品溶液，样品孔加50ul样品。 C.6.5 所有微孔加100ul稀释的酶标物。 C.6.6 除空白孔外，每个微孔加入100ul氯霉素抗体溶液。 C.6.7 混匀后在2-8℃温浴2小时并轻轻晃动微孔板（温浴过程中必须要晃动）。 C.6.8 温浴完成后清空微孔，并清洗3遍（按A6.3）。 C.6.9 每个微孔加150ul 配好的显色底物溶液，混匀后避光室温下温浴30min。 C.6.10每个微孔加入50ul中止液，混匀后30min内在450nm检测吸光度。 C.7结果计算 根据下列公式进行结合率的计算： 标准的吸光度值(或样品)―空白孔的吸光度值 ------------------------------------------------------x 100= （B/B0）%吸光度值 零标准的吸光度值―空白孔的吸光度值 将标准品的B/B0值在半对数曲线中作出一标准曲线，纵坐标为结合率（%），横坐标为浓度（ng/ml）。各样品的结合率通过该曲线都可以定量到一个浓度值。 而要获得样品中氯霉素的ppb（ng/g）浓度值还需要乘上相应的稀释因子（1:10）。 本方法检测限为50ng/ kg。 C.8 注意事项 C.8.1 试剂盒应放在2℃-8℃保存。 C.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 C.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。 附 录 D （规范性附录） 可食性动物组织中己烯雌酚的检测方法（ELISA法） D.1 测定原理 分析反应在羊抗兔IgG包被的微孔中进行，抗己烯雌酚抗体、己烯雌酚的酶标物、己烯雌酚标准品或样本加入后，4℃下温浴过液，清洗去除未结合的酶标物，加入酶标底物（H2O2）和显色剂（TMB），温室下避光温浴30min，加入反应终止液会使微孔中的兰色变黄色，在450nm处进行吸光度测量，通过计算比例可以获得样本中己烯雌酚的浓度值。 D.2 试剂和材料 D.2.1 己烯雌酚酶联免疫试剂盒：意大利Tecna公司生产或类似产品。 D.2.2 醋酸乙酯。 D.2.3 叔丁基甲基醚（Tert-butyl methyl ether）。 D.3 仪器和设备 D.3.1 离心机。 D.3.2 组织均质仪。 D.3.3 酶标仪（含450nm滤光片）。 D.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 D.4 样品处理 ----一份肌肉或肝脏切碎与三份水一起均质化 ----1g均质物（相当于0.25g肌肉）用2ml叔丁基甲基醚（Tert-butyl methyl ether）涡旋混合提取。 ----20，000g离心30分钟，冷冻。 ----分离有机液相并蒸干。 ----用1ml稀释液溶解，涡旋后，用于分析检测（最后的稀释度1：4）。 D.5 工作液的准备 D.5.1 标准品溶液 浓度序列如下：0; 0.1; 0.2; 1; 2; 10; 20ng/ml。 D.5.2 已烯雌酚酶标物 本品是浓缩物，酶标物经过稀释以后稳定性降低，因此要根据用量进行稀释。本浓缩物可以用稀释液稀释100倍（即10ul酶标物+990ul稀释液）。 D.5.3 清洗液 清洗液经过10倍的浓缩，请用蒸馏水稀释。 D.5.4 稀释液 经过10倍的浓缩，请用蒸馏水稀释。 D.5.5 中止液。 D.5.6 已烯雌酚抗体 冻干的抗体用6ml稀释液溶解后彻底混匀，使用后请立即在2℃-8℃避光保存。 D.5.7 显色底物溶液 本溶液应该在使用前根据用量由H2O2和TMB等体积混合。 D.6 实验步骤 D.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温（约1小时）。 D.6.2 预先进行编号，标记B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 D.6.3 用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复3次，在吸水纸上拍打将微孔中的液体去除。 D.6.4 空白孔加150ul稀释液，标准孔加50ul标准品溶液，样品孔加50ul样品。 D.6.5 所有微孔加100ul稀释的酶标物。 D.6.6 除空白孔外，每个微孔加入100ul已烯雌酚抗体溶液。 D.6.7 混匀后在2℃-8℃温浴过夜。 D.6.8温浴完成后清空微孔，并清洗3遍（按5.3）。 D.6.9 每个微孔加150ul 配好的显色底物溶液，混匀后避光室温下温浴30min。 D.6.10每个微孔加入50ul中止液，混匀后30min内在450nm检测吸光度。 D.7 结果计算 根据下列公式进行结合率的计算： 标准的吸光度值(或样品)―空白孔的吸光度值 -----------------------------------------x 100= （B/B0）%吸光度值 零标准的吸光度值―空白孔的吸光度值 将已烯雌酚标准品的B/B0值在半对数曲线中作出一标准曲线，纵坐标为结合率（%），横坐标为浓度（ng/ml）。各样品的结合率通过该曲线都可以定量到一个浓度值。 而要获得样品中已烯雌酚的ng/ml浓度值还需要乘上相应的稀释因子（1:4），这是基于抽提回收率为100%的假设。 本方法检测限为100ng/ kg。 D.8 注意事项 D.8.1 试剂盒应放在2℃-8℃保存。 D.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 D.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。 附 录 E （规范性附录） 可食性动物组织中磺胺类的检测方法（ELISA法） E.1 测定原理 分析反应在抗磺胺类药物抗体包被的微孔中进行。标准品、样品和酶标物加入微孔后，在首次温浴中，标准品或样品游离的磺胺类药物分子与磺胺类药物-酶标物竞争与抗体结合点结合。 首次温浴后，没有结合的分子被清洗去，酶在第二次温浴中可以使无色的显色剂变兰，再加入反应终止液会使微孔中的兰色变黄色，在450nm处进行吸光度测量，通过计算比例可以获得样本中磺胺类药物的浓度值。 E.2 试剂和材料 磺胺类药物酶联免疫试剂盒：意大利Tecna公司生产或类似产品。 E.3 仪器和设备 E.3.1 离心机。 E.3.2 组织均质仪。 E.3.3 酶标仪（含450nm滤光片）。 E.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 E.4 样品处理 组织（肌肉、肝脏和肾脏） ----取1g样本加入9ml稀释液； ----在组织均质仪中均质化； ----2000g离心5min或过滤，用上清液或过滤液直接检测（最后的稀释度1：10）。 E.5 工作液的准备 E.5.1 标准品溶液。 E.5.2 酶标物 用12ml酶稀释液缓慢溶解，等待4小时，然后用正倒方法换匀，注意不要用涡旋。 E.5.3 清洗液 用蒸馏水10倍稀释。 E.5.4 稀释液 用蒸馏水10倍稀释。 E.5.5 中止液 已经备用。 E.5.6 显色液 用柠檬酸缓冲液1：20（1+19）稀释显色剂，在使用前准备。 E.6 实验步骤 E.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温（约1小时）。 E.6.2 预先进行编号，标记B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 E.6.3 空白孔加200ul稀释液，B0孔中加入100ul稀释液，标准孔加100ul各标准溶液，样品孔加100ul样品。 E.6.4 除空白外，所有微孔加100ul稀释的酶标物。 E.6.5 混匀后在室温（20℃-25℃）温浴10min。 E.6.6 用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复3次，在吸水纸上拍打将微孔中的液体去除。 E.6.7 每个微孔加200ul 配好的显色液，混匀后避光室温下温浴10min。 E.6.8 每个微孔加入50ul中止液，混匀后60min内在450nm检测吸光度。 E.7 结果计算 以0标准吸光度值为100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。 标准的吸光度值(或样品) 相对吸光度值（%） = ---------------------------------x 100 0标准的吸光度值 计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线（ng/ml）。 而要获得样品中磺胺类药物的ppb（ng/g）浓度值还需要乘上相应的稀释因子（1:10）。 本方法检测限为500ng/ kg。 E.8 注意事项 E.8.1 试剂盒应放在2℃-8℃保存。 E.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 E.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。